Mengenal Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi merupakan salah satu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan atau menganalisis campuran kompleks suatu senyawa. Komponen yang akan dipisahkan akan terdistribusi ke dalam dua fase, yaitu fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Kromatografi menurut IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) adalah metode yang digunakan terutama untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang dilapiskan pada padatan atau gel. Penggolongan jenis kromatografi dapat dilakukan menggunakan berbagai metoda, antara lain berdasarkan jenis fase yang terlibat, sistem geometri dan prinsip pemisahannya. 

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah salah satu contoh kromatografi planar. KLT adalah metode paling sederhana dari semua metode kromatografi yang banyak digunakan. Bejana tertutup (chamber) berisi pelarut dan plat yang terlapisi adalah peralatan yang diperlukan untuk melakukan pemisahan, analisis kualitatif dan semikuantitatif (Sherma dan Fried, 2003). 

Prinsip dasar KLT yaitu sampel dalam jumlah kecil diletakkan di dekat salah satu ujung fase diam berupa lapisan tipis penjerap, untuk membentuk zona awal. Sejauh ini, silika gel adalah lapisan tipis pada plat penjerap yang paling sering digunakan. Sampel dalam lapisan tipis tersebut kemudian dikeringkan. Lapisan tipis ditempatkan ke dalam fase gerak yang biasanya berisi campuran 2 s.d. 4 pelarut murni, dalam bejana tertutup atau chamber. Jika lapisan tipis dan fase gerak yang dipilih tepat, maka komponen campuran akan bermigrasi pada tingkat yang berbeda selama perpindahan dari fase gerak melalui fase diam. Ketika fase gerak telah berpindah pada jarak yang tepat, fase diam diambil dari bejana tertutup, dan fase gerak dikeringkan. Daerah perpindahan masing-masing komponen dalam campuran dideteksi menggunakan sinar UV dengan atau tanpa menggunakan reagen penampak bercak (Sherma dan Fried, 2003).

Perbedaan migrasi adalah hasil dari berbagai tingkat afinitas campuran komponen pada fasa diam dan fasa gerak. Berbagai mekanisme pemisahan terlibat, dan faktor dominan tergantung pada sifat yang tepat dari dua fase dan zat terlarut. Interaksi yang terlibat dalam menentukan retensi kromatografi dan selektivitas meliputi ikatan hidrogen, pasangan elektron donor / pasangan elektron akseptor (transfer muatan), ion-ion, ion-dipol, interaksi Van der Waals, interaksi dipol-dipol (Keesom), dipol-dipol terinduksi (Debye), dan interaksi dipol-dipol terinduksi sesaat (London) (Sherma dan Fried, 2003).

Pendeteksian paling mudah adalah ketika campuran senyawa yang diamati merupakan senyawa berwarna, berfluoresensi, atau menyerap sinar UV. Namun kebanyakan campuran senyawa memerlukan reagen penampak bercak yang diaplikasikan dengan cara disemprot atau dicelupkan. Absorbsi sinar UV biasanya terjadi pada banyak senyawa aromatik, senyawa yang memiliki ikatan konjugasi, dan beberapa senyawa tak jenuh. Senyawa-senyawa tersebut dapat dideteksi dengan mudah di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm pada plat yang telah diberi indikator fluoresensi  (Sherma dan Fried, 2003).

Identifikasi senyawa pada KLT didasarkan pada perbandingan nilai Rf senyawa hasil dengan senyawa standar otentik. Nilai Rf sifatnya tetap dan merupakan pedoman untuk mengetahui urutan dan jarak perpindahan relative senyawa. Faktor yang menyebabkan nilai Rf bervariasi adalah dimensi dan tipe chamber,bahan dan ukuran plat, arah aliran fase gerak, volume dan komposisi fase gerak, kondisi kesetimbangan, kelembaban, dan preparasi sampel untuk KLT (Sherma dan Fried, 2003).

Nilai Rf diperoleh dari:

Rf =  (Jarak migrasi zat terlarut) 

         (Jarak migrasi fase gerak) 

Referensi:

Sherma, J., dan Fried, B., 2003, Handbook of Thin-Layer Chromatography, edisi ketiga, Marcel Dekker, New York.