KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

Kromatografi pertukaran Ion (Ion Exchange Chromatography) merupakan teknik analisis yang penting untuk pemisahan senyawa ionik. Teknik ini merupakan bagian dari kromatografi ion. Kromatografi pertukaran ion juga merupakan bagian dari kromatografi cair karena fase gerak yang digunakan berupa cairan atau larutan, melibatkan kolom pemisahan dan detektor untuk menganalisis senyawa yang dielusi dari kolom. Kromatografi pertukaran ion dapat diterapkan untuk penentuan analit yang bersifat ionik, seperti anion anorganik, kation, logam transisi, dan asam organik dengan berat molekul rendah dan bersifat basa. Metode ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis molekul bermuatan termasuk protein besar, nukleotida kecil dan asam amino. Metode ini juga sering digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi ion dalam berbagai matriks¹.

Kromatografi penukar ion merupakan teknik yang dirancang khusus untuk pemisahan senyawa bermuatan berbeda atau senyawa yang dapat terionisasi, terdiri dari fase gerak dan stasioner/ fasa diam yang serupa dengan teknik kromatografi cair lainnya yang berbasis kolom^3-5. Fasa gerak terdiri dari sistem buffer atau penyangga yang berperan untuk memisahkan senyawa campuran. Fase diam biasanya dibuat dari matriks organik yang bersifat inert dengan gugus fungsi terionisasi yang membawa ion bermuatan berlawanan yang dapat dipindahkan⁵. Analit yang mengandung kation dipisahkan pada kolom  berisi resin penukar kation sedangkan analit yang mengandung anion dipisahkan pada kolom berisi resin penukar anion⁴.

Ion analit dan ion bermuatan sama dari eluen berkompetisi untuk berikatan dengan gugus fungsi ionik bermuatan berlawanan pada permukaan fase diam. Dengan asumsi bahwa ion pertukaran (analit dan ion dalam fase gerak) adalah kation, kompetisi dapat dijelaskan dengan menggunakan persamaan berikut;

S-X^-C⁺ + M⁺ ↔ S-X^-M⁺ + C⁺

Dalam proses ini kation M⁺ dari eluen dipertukarkan dengan kation C+ dari analit yang terikat pada anion X- yang terdapat pada permukaan fasa diam atau stasioner. Sementara itu, pada kromatografi pertukaran anion, ion yang dipertukarkan bermuatan negatif (anion)  dan persamaannya dituliskan sebagai berikut;

S-X⁺A^- + B^- ↔ S-X⁺B^- + A^-

Anion B^- yang berasal dari eluen akan menggantikan anion A^- dari analit untuk berikatan dengan  ion X⁺ yang bermuatan positif pada permukaan fase diam. Adsorpsi analit ke fase diam dan desorpsi oleh ion eluen diulang selama proses elusi di kolom, sehingga pemisahan terjadi karena adanya pertukaran ion⁸. Secara ringkas, proses pertukaran ion dibagi menjadi lima tahapan sebagai berikut.

1.    Equilibration

Fasa diam sebagai medium pertukaran ion disetimbangkan dengan buffer

2.    Sample Application

Protein dengan muatan berlawanan berikatan dengan fasa diam, ter-konsentrasi pada kolom.

3.    Elution

Peningkatkan kekuatan ionik buffer menggantikan protein  yang terikat pada fasa diam.

4.    Elution

Peningkatan kekuatan ionik lebih lanjut menyebabkan protein yang bermuatan lebih tinggi lepas dari fasa diam.

5.    Washing

Peningkatan kekuatan ionik menghilangkan semua protein yang terikat pada fasa diam  sebelum penyetimbangan kembali.

Berdasarkan pada keberadaan gugus fungsionalya, resin penukar ion dapat secara luas diklasifikasikan dalam empat jenis, yakni :

1.      Penukar kation asam kuat dengan gugus fungsi penukar asam sulfonat (SCX/Strong Cation Exchanger).

2.      Penukar kation asam lemah dengan gugus fungsi penukar asam karboksilat (WCX/Weak Cation Exchanger).

3.      Penukar anion basa kuat dengan gugus fungsi penukar ion amonium kuartener (SAX/Strong Anion Exchanger) .

4.      Penukar anion basa lemah dengan gugus fungsi penukar ion amonium primer, sekunder, tersier (WAX/Weak Anion Exchanger). Berikut ini adalah tabel jenis resin penukar ion beserta nama dagangnya.

Tabel 1. Jenis Resin Penukar Ion

Tipe resin	Gugus fungsi	Nama dagang
Kation: Asam kuat	Asam sulfonat: R-SO3-H+	Permutit Q, Purolit C-100, Duolite C-20, Dowex 50, AmberliteIR -120
Kation : Asam lemah	Asam karboksilat: R-COO-H+	Permutit H-70, Amberlit IRC-50
Anion: Basa kuat	Ion amonium kuartener: [R-CH2N(CH3)3]+Cl-	Dowex-1/SBR-P, Permutit S-1, Amberlite IRA-400, Purolite A-400
Anion: Basa lemah	Gugus amine: [R-NH(R)2]+Cl-	Dowex-3, Permutit W, Amberlite IR-45

Setiap jenis penukar ion memiliki karakteristik yang berbeda, untuk resin penukar ion  asam dan basa kuat (SAX dan SCX), SAX dan SCX akan bermuatan sepenuhnya pada semua kisaran pH yang digunakan pada sistem HPLC, sehingga nilai kapasitasnya tidak dapat diubah melalui peningkatan atau penurunan nilai pH. SAX dan SCX digunakan pada pemisahan asam dan basa lemah, atas dasar bahwa muatan analit yang terdapat di dalam sampel tidak akan terionisasi sepenuhnya, karena dipengaruhi oleh nilai pH fase gerak. Akan tetapi, jika analit tersebut adalah asam atau basa kuat, nilai retensi mereka sangat sulit dipengaruhi oleh nilai pH fase gerak, karena mereka akan terionisasi sepenuhnya meskipun menggunakan kisaran pH yang besar. Dapat dikatakan SAX dan SCX tidak dapat digunakan dalam pemisahan asam dan basa kuat. Pada pH ekstrim, SCX akan dalam bentuk H⁺-nya (pH < 2) dan SAX akan dalam bentuk OH^—nya (pH > 10), dan dapat mengkatalisis berbagai macam reaksi (hidrolisis ikatan ester dan peptida serta disproponasi aldehid), sehingga dapat mengubah sampel⁹. 

Sementara itu, untuk Penukar ion asam dan basa lemah (WAX dan WCX), WCX tidak akan terdisosiasi sepenuhnya jika pH fase gerak lebih kecil 2 unit nilai pH dari nilai pKa-nya. WCX berada dalam bentuk hidrogennya pada pH tersebut dan protonnya terikat sangat kuat, sehingga tidak dapat ditukar dengan kation yang berada si dalam sampel. Dapat dikatakan bahwa kapasitasnya hampir mencapai nol. Akan tetapi, WCX akan terdisosiasi sepenuhnya jika pH fase gerak lebih besar 2 unit nilai pH dari nilai pKa-nya dan gugus fungsi ioniknya akan berinteraksi dengan sampel pada kapasitas maksimal. Pada pH mendekati nilai pKa-nya, WCX akan terdisosiasi setengahnya⁹.

REFERENSI

1   Moustafa, Y.M. dan Morsi, R.E. 2013. Ion Exchange Chromatography-An Overview. In tech, http://dx.doi.org/10.5772/55652

2   Haddad, P.R., Jackson, P.E. 1990. Ion Chromatography. Journal of Chromatography Library, Volume 46.

3   Wisel A, Schmidt-Traub H, Lenz J, Strube J. 2003. Modelling gradient elution of bioactive multicomponent systems in non-linear ion-excahnge chromatography. Journal of Chromatography A,1006 101-120.

4   Fritz JS, Gjerde DT. Ion Chromatography (Fourth Completely Revised and Enlarged Edition). Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH & KGoA Weinhein; 2009.

5   Cummins PM, Dowling O, O’Connor BF. Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application to the Partial Purification of Soluble Mammalian Prolyl Oligopeptides. In: Walls D, Loughran ST. (ed.) Protein Chromatography Methods and Protocols. New York: Springer; 2011. p215-228.

6   Fritz JJ. Early milestones in the development of ion-exchange chromatography: a personal account. Journal of Chromatography A 2004;1039 3-12.

7   Okada T. Nonaqueous ion-exchange chromatography and electrophoresis Approaches to nonaqueous solution chemistry and design of novel separation. Journal of Chromatography A 1998; 804 17-28.

8   Bhattacharyya L., Rohrer, J.S. 2012. Applications of Ion Chromatography for Pharmaceutical and Biological Products. New Jersey: John Wiley & Sons. 

9   Meyer, V.R. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography Fifth Edition, Switzerland: Wiley.